شرایط ویژه آزمایشگاهی تولید قارچ

پس از تکمیل آزمایشگاه نوبت به تهیه محیط کشت مغذی آگار می‌رسد. آگار محصولی است که از نوع جلبک دریایی بدست آمده و برای سفت کردن محیط کشت بکار می‌رود و از نظر ظاهری بسیار شبیه ژلاتین است اما از نظر کاربرد، به مراتب از ان سودمندتر است. در زمینه تولید محیط کشت آگار غنی شده که مناسب قارچ‌های خوراکی می‌باشد، فرمول‌های زیادی وجود دارد، که از آن میان می‌توان به فرمول‌های استاندارد PDA و MEA همراه با مکمل خمیر‌مایه اشاره نمود.

محیط‌های کشت توصیه شده

مخلوطی از دانه‌های جوشانده شده گندم یا چاودار غنی شده با شیر مالت است. برای افزایش رشد می‌توان به محیط کشت زایلوز و آرابینوز( از قندهای پنچ کربنه پنتوزی متبلور) اضافه کرد.

از جمله مواد لازم دیگر برای محیط کشت می‌توان کلسیم، بیوتین، تیامین، اسید‌های آمینه اسپاراژین آلانین و گلایزین را نام برد.

در ادامه توضیحات در مورد ۳ نوع فرمول مغذی آگار صحبت می‌کنیم که هر کدام از آنها برای رشد میسلیومهای انواع مختلف قارچ خوراکی همچون دکمه‌ای، صدفی؛ شی‌تاکه، استروفاریا، چینی، پانالوس و سیلوسب استفاده می‌شود.

برای افزایش رشد میسلیوم‌ها به هر محیط، مقداری پودر چاودار و یا عصاره آن افزوده شود. بعد از انتخاب هر یک از فرمول‌های زیر ترکیبات آن را بصورت خشک با هم مخلوط کرده، درون یک فلاسک ریخته و در نهایت با افزودن آب حجم را به یک لیتر برسانید.

الف) آگار PDY(مخمر دکستروز سیب‌زمینی)

۱-عصاره صاف شده ۳۰۰ گرم خلال سیب‌زمینی که در یک لیتر آب تا یک ساعت جوشیده باشد.                                          ۲-۱۰ گرم قند (گلوکز راست گرد)(قند دکستروز)

۳- ۲گرم مخمر (اختیاری)

۴- ۲۰ گرم آگار

ب) آگار MPG(مخلوط بذر- پپتین-مالت)

۱- ۲۰ گرم مالت عسلی رنگ

۲- ۵ گرم پودر بذر چاودار

۳- ۲ گرم پپتین یا نئو پپتین

۴- ۲گرم مخمر (اختیاری)

۵- ۲۰ گرم آگار

ج) آگار MEA (آگار عصار مالت)

۱- ۲۰ گرم مالت  عسلی رنگ

۲- ۲گرم مخمر

۳- ۲۰ گرم آگار

در تهیه محیط کشت، رعایت نکات زیر ضروری است.

۱-ph محیط کشت

گونه‌های متفاوت قارچ برای رشد و نمو در محیط کشت، ph خاص خود را می‌طلبند. بطوری که ph مطلوب برای گونه‌های سیلوب ۷-۶ می‌باشد. در حال که این مقدار برای نوع دکمه‌ای ۷- ۵/۶ می‌باشد. اکثر گونه‌ها، نسبتا مقاوم بوده و بخوبی در دامنه ۵/۷- ۵/۵ رشد می‌نمایند.

Ph کمتر از ۵/۴و بالاتر از ۷ باعث توقف رشد و نمو(هاگ‌ها و میسلیوم‌ها) می‌گردد و چنانچه ph محیط خیلی پایین باشد، محیط کشت خیلی رقیق می‌شود و باید محیط تازه با ph مطلوب آماده شود.

Ph بعد از اتوکلاو کردن تا ۴/۰ واحد کاهش می‌یابد.

۲- ضد عفونی محیط کشت:

این کار معمولا به ۲ روش صورت می‌گیرد.

 الف) با مواد شمیایی مانند الکل ۷۰ درصد، هیپو کلریتسدیم (وایتکس) ۱درصد و بالاخص آنتی بیوتیک‌ها. در هر صورت ساده‌ترین راه، استفاده از مواد گیاهی غیر آلوده است

همچنین می‌توان از نوع دیگر آنتی بیوتیک بنام استرپتومایسین بعد از استریل کردن محیط کشت استفاده کرد.

در مجموع باید از آنتی‌بیوتیک‌ها بصورت موقتی و به مقدار کم استفاده کرد. چون غلظت بالای آنها مانع رشد و نمو بعضی گونه‌ها و از طرف دیگر مقاومت در باکتری‌ها می‌شود.

ب) با بخار:

بعد از اختلاط کامل ترکیبات محیط کشت و در صورت باقی ماندن اثرات باکتری بعد از ضدعفونی شمیایی(آنتی‌بیوتیکها) می‌توان برای رفع هر گونه آلودگی با بخار تحت فشار، محیط کشت را استریل و یا به اصطلاح اتوکلاو نمود.

استریل کردن صحیح، بستگی به زمان فشار درجه حرارت و حجم ماده مورد استریل دارد.

در شرایط عادی می‌توان محیط کشت آماده را داخل ارلن پیرکس( به علت دهانه تنگ آن میزان تهویه، خشک شدن و ضریب آلودگی کاهش می‌یابد) ریخته درب آن را با یک فویل آلومینیومی پوشاند. دقت کنید که حجم آگار درون ارلن نباید از دو،سوم تا سه، چهارم حجم کل ظرف بیشتر شود.                                                                                                      

ظرف کشت را داخل اتوکلاو و یا زودپز معمولی قرار داده و ته زود پز را یک سانتیمتر آب مقطر بریزید تا بخارلازم تامین شود.

طبق دستور عمل شرکت سازنده، درب زودپز را کاملا بسته آن را حرارت دهید، تا بخار فراوان تولید نماید. قبل از بستن، سوپاپ اطمینان بخاررا بگذارید تا بخار آن به مدت ۴ تا ۵ دقیقه خارج شود.

به آرامی فشار را به ۱۵ پوند رسانده و ۳۰ دقیقه در همین فشار نگه‌دارید. توجه کنید دمای ظرف از ۱۲۱ درجه سانتیگراد فراتر نرود چه در غیر این صورت قند موجود در محیط کشت سوخته وبه اصطلاح، کارامل می‌شود که در نتیجه آن رشد میسلیومی متوقف شده، یکسری جهش‌های ناخواسته ژنتیکی پدیدار می‌شود.

از طرفی اتوکلاو کردن بیش از ۳۰ دقیقه باعث ته‌نشین شدن املاح مفید (بخصوصk+) و تجزیه آگار می‌شود.

همچنین باید ظروف خالی شیشه‌ای و کاغذ‌ها بطور جداگانه به مدت ۳۰ دقیقه در دمای ۱۳۰ سانتیگراد(بصورت خشک) استریل نمود.

مراحل پایانی؛ استریل کردن

بعد ازاتمام استریل کردن، زود پز را در آزمایشگاه یا یک اتاق نیمه استریل قرار داده، اجازه دهید تا قبل از باز کردن درب آن، فشار به ۱ پوند کاهش یابد. سپس درب آن را باز نمائید و اقدام به ریختن آگار در بطری دیش‌ها نمائید. باید دانست با هر لیتر از محلول آگار بدست آمده می‌توان ۳۰ بطری دیش ۱۵در ۱۰۰ میلی‌متر را پر نمود.

پیش از پر نمودن بطری دیش‌ها، محلول کشت را به شدت تکان دهید تا محتویات آن خوب پخش شده مخلوطی همگن بدست آید. سپس بگذارید تا آگار خنک شده و یکنواخت گردد و سپس اقدام به پر نمودن بطری دیش‌ها نمائید تا بدین وسیله از تعریق جدار داخلی ظرف که از ریختن محلول آگار ناشی می‌شود، جلوگیری شود.

حال، این محلول آماده کشت هاگ یا بافت زنده می‌باشد که در ادامه روش آنرا خواهیم دید.

گلتوس؛ مجله تخصصی گل و گیاه